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CCK-8試劑盒

Cell Counting Kit -8

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檢測原理

CCK-8試劑盒是一種基于WST-8的廣泛應用于細胞增殖和細胞活性的快速高靈敏度檢測試劑盒。

WST-8屬于MTT的升級產(chǎn)品，能在電子載體1-甲氧基PMS的作用下被還原成水溶性甲臜產(chǎn)物，生成的甲臜量與活細胞數(shù)量成正比，因此顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450 nm波長處測定OD值，可以反映活細胞數(shù)量。

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CCK-8法與普通的MTT法相比，具有顯著特點：

★靈敏度高，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好

★操作簡便，省時省力

★水溶性，不需要換液，尤其適合于懸浮細胞

★無需放射性同位素和有機溶劑，對細胞毒性低

★為1瓶溶液，毋需預制，即開即用

★適合于高通量藥物篩選

CCK-8用途：藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗

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CCK-8方法的優(yōu)勢

CCK-8法與其他細胞增殖/毒性檢測方法的優(yōu)勢比較

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保存條件：

4?C避光保存一年有效，?-20?C避光保存兩年有效。 避免反復凍融。

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CCK-8試劑盒操作說明

CCK-8溶液可直接加到細胞中，不需要與其它組分預混。由于CCK-8溶液非常穩(wěn)定并且細胞毒性很小，所以可以進行長時間孵育，例如孵育24-48小時。

在進行以下實驗之前，可先設置空白對照孔，僅加入相應量細胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液，不加入細胞。

方法一.?制作標準曲線（測定細胞具體數(shù)量）

1、先用細胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量，然后接種細胞到培養(yǎng)板內(nèi)。

2、按比例（例如：1/2比例）依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每個濃度建議3-6個復孔。

3、接種后培養(yǎng)2-4小時使細胞貼壁，然后按培養(yǎng)基體積的10%加入CCK-8試劑，培養(yǎng)一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標（X軸），OD值為縱坐標（Y軸）的標準曲線。根據(jù)此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量（使用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時間。）

方法二.?細胞活性檢測

1、在96孔板中接種細胞懸液（100 μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)一段時間（37℃,5% CO2）。

2、向每孔加入10?μL CCK-8溶液。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。

4、用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

方法三.?細胞增殖-毒性檢測

1、在96孔板中加入90 μL的細胞懸液。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24小時（37℃，5% CO2）。

2、向培養(yǎng)板加入10 μL不同濃度的待測物質(zhì)。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育適當?shù)臅r間（例如：6、12、24或48小時）。

4、向每孔加入10 μL CCK-8溶液。

5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。

6、用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

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活力計算：

細胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(不加藥)-A(空白)] ×100

A(加藥)：具有細胞、CCK?溶液和藥物溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培養(yǎng)基和CCK?溶液而沒有細胞的孔的吸光度

A(0 加藥)：具有細胞、CCK?溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力

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注意事項:

1，由于使用96孔板進行檢測，如果細胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸發(fā)問題。一方面，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的PBS、 水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。

2，本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應， 所以還原劑(例如一些抗氧化劑)會干擾檢測。如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。培養(yǎng)基中酚紅和血清的吸光度，在計算時通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

3，有條件的情況下建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK-8試劑時，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基頁面下加，容易產(chǎn)生氣泡，會干擾OD值讀數(shù)。加完之后最好能夠離心，以免CCK-8液滴懸掛在壁上。用酶標儀檢測前需確保每個孔內(nèi)沒有氣泡，否則會干擾測定。

4，若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10?μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。

5，建議先做幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間。白細胞可能需要培養(yǎng)較長時間。若使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

6，若沒有450nm的濾光片，可使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片，但是450nm濾光片的檢測靈敏度最高。

7，金屬對CCK-8顯色有影響。終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、CuSO4會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話，將會100%抑制。

8，本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。